流式细胞术检测的工作原理

在流式细胞术中使用的仪器称为流式细胞分析仪，通常缩写为“细胞分析仪"。流式细胞分析仪由一个用于进行细胞处理的流体系统和一个包括数据采集信号检测器和处理器的光学系统组成。专为 FACS 设计的仪器还包含一个细胞分选组件，该组件可将细胞引导到不同的捕获容器中。

流体系统设计用于生成单细胞的均匀流，以确保当细胞被用于检测的光源照射时，能够进行适当分析。这通过使用加压管将细胞从样品管注入流室中来完成。从容器（通常是一根试管或一块多孔板）中抽取细胞样品，并将其注入流动液体（称为鞘液）层流中间的流室中。通过一个称为流体动力学聚焦的流程，鞘液可帮助缩窄细胞流，从而将细胞组织成一行大致单行的流线。

流式细胞分析仪的光学系统包括照明源、过滤器、透镜和收集光学器件。照明源常包括 1 个或多个激光束，且每个激光器发射的光波长不同。检测器不区分各种光波长，而是通过放置在光路径中的过滤器来将光限制在所需波长范围内。

流式细胞术检测的工作原理：抗体、荧光团和细胞染料的重要性

为了通过流式细胞术分析特定靶标，对细胞组分进行荧光标记。这可以通过使用单独的荧光分子（例如，细胞染料）或荧光团标记的抗体（直接偶联抗体或使用偶联二抗）来完成。

流式细胞术中抗体的使用

抗体是许多生物检测中的关键工具，在流式细胞术中也不例外。抗体具有特异性结合单个蛋白或蛋白修饰的能力，并且可作为一种方法来标记那些用于进行检测的靶标。通过标记目的靶标，研究人员可以评估各种细胞类型、疾病状态、治疗条件、发育阶段或其他生物模型中蛋白的丰度或活性。

与不同蛋白结合的抗体不会相互干扰，因此，可以使用多种抗体同时检测多个靶标。这称为多重分析。抗体数量的限制是独立于其他抗体测定每种抗体的能力。在流式细胞术中，这种差分测定使用称为荧光团的荧光分子来完成。成功的实验要求具有高度特异性和经验证的抗体以及可靠的荧光团。

流式细胞术中荧光团的使用

荧光团的共同特性是能够发射与用于照亮染料的光相比波长更长的光。例如，如果使用蓝色激光器来照亮称为绿色荧光蛋白 (GFP) 的分子，那么蛋白会吸收蓝光并发射绿光。被吸收的光与被发射的光之间的波长差异称为斯托克斯位移。

就是这种位移让人们能够准确定量来自荧光团的光，因为它能够过滤来自激发源的光的波长。激发源总是比从正在分析的荧光团中发射的荧光更亮些，并且如果这种光无法移除，那么它将会强烈影响检测器。

荧光染料吸收的光的范围称为“激发"光谱，而激发时其发出的荧光称为“发射"光谱。激发和发射光谱针对所有常见染料提供，并呈曲线显示各波长下吸收或发射的光量。

流式细胞术中的偶联抗体：直接与间接荧光团标记

通常，在流式细胞术实验中用于获取读数的荧光团会与抗体共价结合。该过程称为偶联，并且该抗体-荧光团配对称为偶联物。当在一项细胞检测中使用偶联抗体时，荧光团发射的光可作为细胞内或细胞上存在的抗体量的一个直接指标。（由于细胞膜是透光的，细胞内荧光团发射的光不会显著衰减。）通过使用特异性结合蛋白或蛋白修饰的偶联物，研究人员可以根据每个细胞发射的荧光水平，直接量化该细胞中的目的靶标。该过程称为直接检测或直接流式细胞术。

直接：直接偶联抗体

• 可直接多重分析来自同一宿主的抗体

• 由于孵育和洗涤步骤更少，因此实验步骤更快

• 能够在一项检测中使用许多不同的抗体，从而能够同时读取大量终点

间接：非偶联一抗 + 偶联二抗

• 可改善以低丰度存在的靶标的检测，同时由于二次放大可提供更高的灵敏度（多个二抗结合一个一抗）

• 当直接偶联物尚未获得时，有益于一抗的初始验证

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